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iGEM Team Aachen 2018 Das aktuelle iGEM-Team der RWTH Aachen University The current iGEM-Team of RWTH Aachen University

Biosensor

Unser Sensor besteht aus zwei Teilen: Einersets aus der Entwicklung von Melatonin-spezifischen Rezeptoren mittels Methoden der Biotechnologie; anderseits aus der Entwicklung eines sensetiven Sensors, in diesem einer der Rezeptoren dann eingebaut wird. Ziel ist es die Melatoninkonzentration in einer Speichelprobe ohne vorheriges aufreinigen zu ermöglichen.
Der Sensor basiert auf dem Prinzip der Plasmon Resonanz. Plasmon Resonanz beschreibt die Schwingung der freien Elektronen in einem Metall. Ein gutes Video welches das Grundprinzip vorstellt finden Sie hier. Eine genauere Erläuterung zu Localized Surface Plasmon Resonance finden Sie hier.
Bei der Entwicklung eines Melatonin-spezifischen Rezeptors verfahren wir zweigleisig. In beiden Ansätzen wird ein menschlicher Rezeptor in Saccharomyces cerevisiae eingebaut. Für die Messung werden wir zwei verschiedene Systeme nutzen:


Nukleärer Rezeptor & Reportergen:

Melatonin hat eine hohe Membranpermeabilität, was uns ermöglicht einen Rezeptor zu nutzen, der im Zellkern vorliegt. Die Gene, die durch den nukleären Retinoid Z Receptor (RZR) reguliert werden, sind in Hefen nicht vorhanden, sodass wir einen chimären Rezeptor konstruieren werden, über den die Expression von bekannten Reportergenen reguliert wird. Dafür werden wir RZR als Fusionsprotein mit dem menschlichen Östrogen Rezeptor alpha (ERα) exprimieren. Nachdem Melatonin am chimären Rezeptor gebunden hat, kann dieser so am estrogen receptor responsive element (ERE) binden, welches das firefly luciferase Reporter-Gen beinhaltet. Die Signalstärke der Luciferase ist dosisabhängig vom vorhandenen Liganden.

Enzyme-Fragment Complementation Assay:

Für dieses Assay wollen wir uns das sogenannte β-Arrestin zu Nutze machen, welches an aktvierten G-Protein gekoppelten Rezeptoren, wie dem Melatonin Rezeptor MT1, bindet. Wird ein Enzym in zwei Fragmenten gebildet, so können diese, wenn sie sich zusammenfinden, wieder ein aktives Enzym bilden. In unserem Fall werden zwei β-Galactosidase-Fragmente als Fusionsproteine mit dem Rezeptor MT1 und dem β-Arrestin exprimiert, sodass durch die Rezeptor-Aktivierung durch Melatonin wieder ein aktives Enzym entsteht. Über die Messung der Produktbildung durch dieses Enzym wollen wir die Melatoninkonzentration bestimmen.

Our approach is to genetically modify Saccharomyces cerevisiae by integrating a highly specific human melatonin receptor into the cells. This will allow us to detect melatonin from a saliva sample without previous purification. To get a signal from the melatonin binding, we will use two different signalling systems:


Using a nuclear receptor and a reporter gene:

The membrane permeability for melatonin is high. This permits us to use the nuclear retinoid z receptor (RZR) which is directly regulating gene expression. As the genes regulated by RZR do not exist in S. cerevisiae, we plan to create a chimeric receptor consisting of the RZR and the recognition sequence of the human estrogen receptor alpha (ERα). When melatonin is bound, the modified receptor can bind to the estrogen receptor responsive element (ERE) and as a consequence regulate expression of firefly luciferase reporter genes. The signal intensity of luciferase is dose-dependent in the presence of ligands.

Enzyme-Fragment Complementation Assay:

When melatonin binds to the G protein-coupled receptor MT1, β-arrestins can be recruited. We are going to use this mechanism by designing two fusion-proteins: on the one hand the MT1 receptor will be fused to a fragment of an enzyme, on the other hand, the complementing enzyme fragment will be fused to the β-arrestin. Thus, receptor activation leads to β-arrestin recruitment and therefore to the formation of an active enzyme.